L'Orto, di un'estensione di circa due ettari e mezzo, si trova in prossimità di Porta Tufi e vi si accede attraverso un ingresso, aperto nel 1866, abbellito da due vasche con piante acquatiche. 

Di un Orto dei Semplici, annesso all'Ospedale di Santa Maria della Scala, utilizzato per la coltivazione di piante curative, si hanno notizie fin dall'inizio del XVII secolo. Nel 1784 fu trasformato, per ordine del granduca Pietro Leopoldo di Toscana, in Orto Botanico Universitario ed un secolo dopo nel 1856 fu trasferito per necessità d'ampliamento in un terreno presso l'Accademia dei Fisiocritici. 

Le dimensioni e l'impianto attuali si devono agli interventi dei vari direttori succedutesi nel tempo. Nel 1860 fu ampliato e dotato d'attrezzature come la serra calda per la coltivazione di piante esotiche. Nel 1964 fu raddoppiata l'estensione e furono costruiti nuovi edifici per gli istituti universitari che inglobarono una serra fredda Ottocentesca. 
Nel pendio in cui sorge s'individuano tre settori ben distinti. 
Un giardino roccioso e un felceto di recente costruzione fanno ammirare piante toscane di norma poco osservate. Nella restante parte, dove si è tentato di mantenere l'aspetto che un tempo doveva avere il terreno all'interno delle mura, si coltivano piante da frutto, oggetto di ricerca. 

Le piante tropicali come orchidee, felci ed agavi, sono poste nell'antica serra costruita alla fine dell'Ottocento. Nel tepidario trovano riparo piante d'ambienti semidesertici, come cactus americani ed euforbie africane.